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| Diploma Thesis | PreJuSER-46985 |
2005
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag
Jülich
Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/427
Report No.: Juel-4176
Abstract: Die Kenntnis des Kontaktbereiches zwischen einer elektrisch aktiven Zelle und der Oberfläche eines Feldeffekttransistors ist von großer Bedeutung für das Verständnis der mit dem FET abgeleiteten Zellsignale. Frühere Arbeiten zeigten die Bedeutung eines hohen Abdichtwiderstandes R$_{J}$ zwischen dem von der Zelle bedeckten Transistorgate und der umliegenden Badlösung auf. Neben den elektrochemischen Eigenschaften der Elektrolytlösung bestimmt vor allem die geometrische Beschaffenheit des Spaltes zwischen der Zelle und dem Gate diesen Widerstand. Wie Arbeiten zur Modellbildung des Zell- transistor-Kontaktes zeigen, hat vor allem die Höhe dieses Spaltes einen dominierenden Einfluss auf R$_{J}$ und somit auf die Einkopplung der Zellsignale in den Transistor. In der vorliegenden Arbeit konnte der Kontaktbereich zwischen adhärierten HEK-Zellen und ihrem Substrat mit elektronenoptischen Methoden sowie mit Hilfe der Frequenzspektroskopie charakterisiert werden. Durch eine Anpassung der Zell-Präparation für die Rasterelektronenmikroskopie konnte eine optimale Erhaltung der Zellen erreicht werden. Aufgrund des limitierten Einblickes in den Spalt konnte jedoch mit dem REM keine exakte Aussage über die Geometrie des Kontaktbereiches getroffen werden. Vielmehr ergab sich das Bild, dass die Zellen Substratstufen, wie sie auch an einem Transistorgate vorzufinden sind, brückenartig überspannen. Im Folgenden wurden mit einer FIB-Anlage Teile von Zellen sowie darunterliegende Schichten des Substrats in Form eines Querschnitts abgetragen. In der Schnittebene wurde somit die Grenze zwischen der jeweiligen Zelle und dem Substrat sichtbar. Mit dieser Methode war es möglich, das Adhäsionsverhalten einer Zelle an einer Substratstufe zu studieren. Die Zellen passen sich der Substrattopologie exakt an. Somit kann davon ausgegangen werden, dass die Zellen in den elektrophysiologischen Experimenten auf einem FET-Gate vergleichbar eng aufliegen. Aussagen zur exakten Spaltgeometrie konnten anhand der FIB-Querschnitte nicht erfolgen. Ein alternativer Weg zur Visualisierung des Spaltes erwies sich als zielführend. Die Zellen wurden auf Siliziumsubstraten kultiviert und in Epoxidharz eingebettet. Die Substrate wurden entfernt, durch eine dünne Beschichtung ersetzt wiederum eingebettet. Ultradünnschnitte orthogonal zum ehemaligen Substratverlauf wurden unter dem TEM untersucht. Mit den hochaufgelösten TEM-Aufnahmen konnten die Ergebnisse der FIB-Präparation bestätigt werden, dass die Zellen einer Substratstufe eng folgen und Vertiefungen wie ein Transistorgate nicht überspannen. Die Vorstellung, die Zellmembran verlaufe gleichmäßig und mit definiertem Abstand über dem Substrat, nur unterbrochen von fokalen Adhäsionspunkten, konnte anhand der Bilder zur Kontaktgeometrie nicht bestätigt werden. Stattdessen ergab sich eine inhomogene Abstandsverteilung mit Bereichen direkter Zell-Substrat-Adhäsion sowie Bereichen, in denen die Zellen einen Abstand bis zu mehreren 100nm vom Substrat aufrechterhalten. Der Spalt zwischen der Zelle und dem Substrat konnte mit einer Auflösung von 2,2nm visualisiert und vermessen werden. Unter Zuhilfenahme elektronischer Bildverarbeitung konnte für eine Beschichtung des Substrates mit Polylysin ein statistischer Mittelwert für den Zell-Substrat-Abstand von ca. 60nm bestimmt werden. Kontrollen mit anderen Beschichtungen zeigten hingegen ein indifferentes Bild ohne einen eindeutig bevorzugten Abstand. Mit Hilfe der Frequenzspektroskopie konnte eine Grundlage geschaffen werden, den Spalt auch elektrisch charakterisieren zu können. Eine Änderung im Frequenzverlauf der Transferfunktion eines Transistors durch Adäasion einer Zelle auf seinem Gate konnte nachgewiesen werden. Die Frequenzspektroskopie bietet großes Potenzial für weitergehende Untersuchungen. So kann eine Lock-In-Schaltung in die Messverstärker zur Ableitung extrazellulärer Zellsignale mit einem FET integriert werden. Durch Bestimmung der Transferfunktion aller Transistoren eines Chips sollten so verlässliche Aussagen über den Abdichtwiderstand R$_{J}$ der Zellen auf den einzelnen Gates getroffen werden können und Vorhersagen über die Kopplungsstärke der Zellsignale ermöglicht werden. Dies würde bereits vor der langwierigen Kontaktierung der Zellen mit einer Patch-Pipette eine Voraussage über lohnenswerte Zellen ermöglichen, was die Effizienz der Experimente deutlich erhöhen würde. Ebenso wäre es möglich, mit einer parallelen Anwendung der Frequenzspektroskopie während der elektrophysiologischen Experimente auf einem FET Veränderungen von R$_{J}$ zeitaufgeöost zu registrieren. Weitere Anwendungen sind vorstellbar, beispielsweise zur frequenzspektroskopischen Abstandsbestimmung. Auch die Elektronenmikroskopie bietet Spielraum für eine weitergehende Charakterisierung des Zell- Substrat-Kontaktes. So könnte durch Verwendung von Melaminharz anstelle des hier verwendeten Epoxidharzes die Dehydratation der Zellen eingespart werden. Potenzielle Schrumpfungsartefakte der Zellen könnten vermindert werden und die Abstandsbestimmung würde noch verlässlicher. Um das Ablösen der Silizium-Substrate vom Epoxidblock einzusparen, wäre ein Herunterdünnen der Substrate auf wenige $\mu$m denkbar, wodurch Ultradünnschnitte durch sie hindurch ermöglicht würden. Auch eine Kombination zweier hier vorgestellter Methoden wäre anzudenken: Die Zellen auf einem Chip könnten mit einer lediglich dünnen Harzschicht bedeckt werden, um dann in einer FIB-Anlage eine einzelne Zelle aufzuschneiden. Dadurch könnte eine bessere Probenerhaltung gewährleistet werden als beim Trocknen der Zellen. Als alternative Methode zur Bestimmung des Zell-Substrat-Abstandes könnte auch die optische Methode der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie verwendet werden. Diese Methode ähnelt der eingangs vorgestellten FLIC-Methode, jedoch wird hierbei der anregende Lichtstrahl von unten durch das Substrat geschickt, und die Anregung der fluoreszierenden Moleküle in der Zellmembran geschieht durch ein evaneszentes Feld an der Grenzfläche. Auf Basis der in dieser Arbeit gewonnenen elektronenoptischen sowie frequenzspektroskopischen Daten zur Geometrie des Zell-Substrat-Kontaktes soll in zukünftigen Arbeiten ein detailliertes Modell der Einkopplung extrazellulärer Signale elektrisch aktiver Zellen in Feldeffekttransistoren erarbeitet werden.
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